1、內(nèi)標對熒光定量PCR儀的影響
若在待測樣品中加入已知起始拷貝數(shù)的內(nèi)標，則 PCR 反應變?yōu)殡p重 PCR，雙重 PCR 反應 中存在兩種模板之間的干擾和競爭，尤其當兩種模板的起始拷貝數(shù)相差比較大時，這種競爭會表現(xiàn)得更為顯著。但由于待測樣品的起始拷貝數(shù)是未知的，所以無法加入合適數(shù)量的已知模板作為內(nèi)標。也正是這個原因，傳統(tǒng)定量方法雖然加入內(nèi)標，但仍然只是一種半定量的方法。
2、熒光定量 PCR 無需內(nèi)標定量
熒光定量PCR儀技術有效地解決了傳統(tǒng)定量只能終點檢測的局限，實現(xiàn)了每一輪循環(huán) 均檢測一次熒光信號的強度，并記錄在電腦軟件之中，通過對每個樣品 Ct 值的計算，根據(jù) 標準曲線獲得定量結果。實時熒光定量 PCR 無需內(nèi)標是建立在兩個基礎之上的：
?。?）Ct 值的高度重現(xiàn)性 PCR 循環(huán)在到達 Ct 值所在的循環(huán)數(shù)時，剛剛進入真正的指數(shù)擴增期（對數(shù)期），此時微小誤差尚未放大，因此 Ct 值的重現(xiàn)性*，即同一模板不同時間擴增或同一時間不同管內(nèi)擴增，得到的 Ct 值是恒定的。
?。?）Ct 值與起始模板的線性關系由于 Ct 值與起始模板的對數(shù)存在線性關系，可利用標準曲線對未知樣品進行定量測定， 因此，實時熒光定量 PCR 是一種采用外標準曲線定量的方法。
外標法定量和內(nèi)標法定量的方法學比較，得出的結論是：內(nèi)標法作為定量或半定量的手段是不可靠的，而外標準曲線的定量方法是一種準確的、值得信賴的科學方法。熒光定量PCR儀
